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操作步骤 ：

1 、 原代

1. 取材后的人正常肠组织须在 2 - 8℃含有组织保存液的取样瓶中 ，快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离 ，拍照并登记信息 。
2. 准备若干培养皿 ，加入 4℃预冷的人正常肠类器官培养缓冲液备用 。
3. 取样瓶消毒 ，将组织放入培养皿中 ，利用人正常肠类器官培养缓冲液清洗三次后 ，利用眼科剪或手术刀将肿瘤组织剪切成体积约为 1~3 mm³ 的组织块 。
4. 组织用人正常肠原代组织消化液消化 ，37℃震荡消化10-20 min ，（消化过程中随时观察消化情况） 。
5. 取少量液体在显微镜下观察 ，镜下观察到较多的单个细胞或 70μ m 以下的细胞簇后 ，加入三倍体积人正常肠类器官培养缓冲液终止消化 。
6. 使用100μm孔径的筛网进行过滤 ，将滤液收集后 ，于300g富集离心5min后移去上清 ，添加人正常肠类器官培养缓冲液重新重悬离心 。
7. 基质胶计算 ：第6步后观察收集到的组织体积 ，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板 。
8. 24孔细胞培养板为例 ，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作） 。
9. 将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶 ，添加人正常肠类器官培养基（恢复室温）进行培养 。

2 、 类器官传代培养

1. 移液器吸去培养基 ，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液放置2min 。
2. 移液抢轻柔吹打基质胶 ，收集在15ml离心管中 ，4℃静置10min 。（每6-8孔为一组）
3. 1类器官数量不足或体积较小时 ： 离心5min弃去上清 ，添加适量人正常肠类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管 ，300g离心5min弃去液体进行第4步 。

2类器官数量较多或体积较大时 ：离心5min弃去上清 ，添加适量类器官传代消化液消化2-3min ，添加人正常肠类器官缓冲液终止消化 ，离心5min弃去混合液 ，添加适量人正常肠类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步 。

1. 类器官收集后 ，添加基质胶重悬 ，每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中 ，放置培养箱中10-15min添加500μl人正常肠类器官培养基 。

3、类器官冻存

1. 移液器吸去培养基 ，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液放置2min 。
2. 移液抢轻柔吹打基质胶 ，收集在15ml离心管中 ，4℃静置10min 。（每6-8孔为一组）
3. 离心5min弃去上清 ，添加适量人正常肠类器官缓冲液再次重悬 ，300g离心5min弃去液体 。
4. 添加适量类器官冻存液  ，轻柔吹打重悬 ，以24孔细胞培养板为例 ：密度为2个孔冻存1管 ，每管体积1.4ml 。
5. 做好标记信息 ，进行程序降温后 ，移入液氮长期保存 。

4 、 类器官复苏

1. 取10ml人正常肠类器官培养缓冲液于15ml离心管中 。
2. 从液氮罐中取出冻存的类器官细胞 ，快速置于 37℃水浴锅中融解 。
3. 水浴融解过程中 ，需轻轻摇动冷冻管 ，以确保冻存液在 1-2 分钟内完全融解 。
4. 将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管 ，使用移液管轻轻吹打6-8次 ，300g 离心 5分钟 ，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀 。添加适量人正常肠类器官缓冲液重悬移入1.5ml离心管300g离心5min 。
5. 基质胶重悬 ，每孔25μl基质胶铺在24孔细胞培养板中 ，放置培养箱中10-15min成胶 ，添加500μl人正常肠类器官培养基 。