共聚焦显微拍摄的步骤及方法

一 、技术简介

激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置 ，利用计算机进行图像处理 ，把光学成像的分辨率提高了30%-40% ，使用紫外或可见光激发荧光探针 ，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像 ，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值 ，膜电位等生理信号及细胞形态的变化 ，成为形态学 ，分子生物学 ，神经科学 ，药理学 ，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具 。

激光扫描共聚售显微镜以激光作为光源 ，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源 ，经过透镜 、分光镜形成平行光后 ，再通过物镜聚焦在样品上 ，并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描 。样品被激光激发后的出射光波长比入射光长 ，可通过分光镜 ，经过透镜再次聚焦 ，到达探测针孔处 ，被后续的光电倍增管检测到 ，并在显示器上成像 ，得到所需的荧光图像 ，而非聚焦光线被探测针孔光栏阴挡 ，不能通过探测针孔 ，因而不能在显示器上显出荧光信号 。

二 、实验流程

1样品的固定(多聚甲醛固定法) 。

2组织的冷冻包埋和切片(干冰冷冻包埋法)

3免疫荧光标记 。

4先在荧光显微镜下观察确认标记成功 ，然后移至共聚焦显微镜下进行观测 。